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产品说明
MMLV Reverse Transcriptase 2.0为莫洛尼氏鼠白血病毒 (Moloney Murine Leukemia Virus, MMLV) Reverse Transcriptase的升级版，具有依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶活性、依赖于 DNA 的 DNA 聚合酶活性，缺失RNase H 活性。依赖于RNA 的 DNA 聚合酶活性能够以RNA为模板链，合成互补的DNA链(cDNA)；依赖于 DNA 的 DNA 聚合酶活性能够以cDNA单链作为模板，合成互补的双链DNA。Reverse Transcriptase 2.0 的热稳定性显著提高，可以55-60°C反应，在此温度范围内保留了50%以上的酶活性。本酶延伸能力更强，可用于较长的 cDNA 合成。而MMLV Reverse Transcriptase（AE0401）在45度时活性仅有40-50%；50度时所剩活性仅有10%。
本公司MMLV Reverse Transcripase 2.0是重组表达，并经多步纯化的重组酶。
活性定义
37°C 条件下，以 Poly(A) - Oligo(dT)为模板/引物，在 10 分钟内，掺入 1 nmol 的[3H] dTTP 所需要的酶量定义为 1 个活性单位(U)。
浓度：200U/μl
保存条件：-20℃保存特点
Ø 无 RNase H 活性；
Ø 合成 cDNA 的长度优于野生型 M-MLV 反转录酶；
Ø 热稳定性好：耐受55-60°C反应。
适用范围
Ø 第一链 cDNA 合成
Ø 全长 cDNA 合成，制备 cDNA 文库；
Ø RT-PCR 以及 Real Time RT-PCR 反应。
产品包装规格及组成
质量控制
相关测试表明无外源内切、外切脱氧核糖核酸酶污染。PCR 方法检测无宿主残余 DNA。酶贮存缓冲液
20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 200 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 0.01% Nonidet P40, and 50%
glycerol.
应用举例 1 两步法 RT-PCR
l 第一链 cDNA 合成实验
若模板 RNA 是使用 RNA 提取试剂盒提取获得，已经清除了残留基因组 DNA，则可以直接进行以下步骤；否则请先去除 gDNA。
1. 将以下组分加入一个无核酸酶污染的 PCR 管中：
组份 | 体积/μl | 终浓度 |
Oligo(dT)20（50 μM） 或 Random Primers（25 μM） 或 Specific Primer（10 μM） | 1 | 5.0 μM 2.5 μM 1.0 μM |
RNA Template* | 1-5 | 100ng-1μg |
Nuclease-free Water | Up to 10 | / |
总体积 | 10 | / |
* Total RNA 的使用量一般为 10 ng～1 μg；mRNA 的使用量一般为 0.1ng～1 μg。
2. 将以上混合液在 65-70°C 下温育 5-10 分钟，迅速取出置于冰上冷却 2-3 分钟；
3. 继续配制如下反应混合液：
组份 | 体积/μl | 终浓度 |
上述模板RNA/引物变性溶液 | 6 | / |
5×RT Buffer（含 DTT） | 4 | 1× |
dNTPs（10.0 mM） | 1 | 0.5 mM |
MMLV Reverse Transcripase 2.0 (200 U/μl) | 0.5 | / |
RNase Inhibitor (40 U/μl) * | 1 | / |
Nuclease-free Water | Up to 20 | / |
总体积 | 20 | / |
*可选加，为了降低 RNaseA 污染可能导致的 RNA 降解，建议每个反应加1ul。
4. 手指轻柔敲弹混匀后，瞬时离心；
5. 若使用 Oligo(dT)20 或基因特异性引物，42-50°C 反应 30-60 分钟；若使用随机引物，首先 25°C
温育 10 分钟，之后 42-50°C 反应 30-60 分钟；
6. 反应结束后，80℃保温 1-5 分钟失活 RTase，终止反应。然后冰上冷却，用于后续实验，或立即保存于-20°C。
得到的 cDNA 溶液可直接用于第二链 cDNA 的合成或者 PCR 扩增等，PCR 扩增时 cDNA溶液的使用量建议使用 1-5 μl。
l PCR 扩增目标 cDNA 实验
以上述第一链 cDNA 合成实验中获得的含有目标基因的 cDNA 为模板，进行 PCR 扩增。以下 PCR 反应举例为 50 μl 标准 PCR 体系，仅供参考。实际 PCR 条件应根据模板、引物、目的片段大小加以优化，确定最佳反应条件。
按如下配方配制PCR混合液
组份 | 体积/μl | 终浓度 |
10×Taq Buffer | 5 | 1× |
dNTPs（2.0 mM） | 5 | 0.2 mM |
引物 F（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
引物R（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
上述 cDNA 溶液* | 1-4 | / |
Taq（2.5U/μl） | 1.0 | 2.5U |
ddH2O | up to 50 | / |
总体积 | 50 | / |
*50 μl PCR 体系 cDNA template 用量为 10ng-1μg。
PCR 反应条件
95℃ | 5 min | |
95℃ | 15 sec | |
55~72℃ | 20 sec | 30 Cycles |
72℃ | 1-2kb/min | |
72℃ | 1-5 min |
应用举例 2 一步法 RT-PCR
一步法 RT-PCR 将 RNA 反转录合成 cDNA、目标 cDNA 的 PCR 反应合二为一。以下为一步法扩增标准体系（50 μl）。
组份 | 体积/μl | 终浓度 |
5×RT Buffer | 10 | 1× |
dNTPs（2.0 mM） | 5 | 0.2 mM |
引物 F（10 μM） | 2 | 0.3 μM |
引物R（10 μM） | 2 | 0.3 μM |
总 RNA* | X* | / |
Taq（2.5U/μl） | 1.0 | 2.5U |
MMLV Reverse Transcripase 2.0 (200 U/μl) | 0.5 | 100U |
RNase Inhibitor (40 U/μl) | 1 | 40U |
Nuclease-free ddH2O | Z ul | / |
总体积 | 50 | / |
* Total RNA 的使用量一般为 10 ng～1 μg；mRNA 的使用量一般为 1ng～1 μg
PCR 反应条件
42-50℃ | 30 min | |
95℃ | 3 min | |
95℃ | 15 sec |
|
55~72℃ | 20 sec | 30 Cycles |
72℃ | 1-2kb/min | |
72℃ | 3 min |
警告: 本产品仅限科研实验使用，临床应用安全性和有效性未鉴定，不可用于医疗临床诊断。
注意事项
l 建议在冰上配置 PCR 反应液后，再放入 PCR 仪中进行扩增。这有利于提高扩增的特异性， 减少非特异性扩增，得到良好的 PCR 结果。
l 为了降低RNaseA 污染可能造成的 RNA 降解，导致 cDNA 合成失败，强烈建议每个反应加 1μl RNase Inhibitor。
l RNA 相关实验严格放置RNase A 污染，操作时需佩戴一次性口罩与手套，并及时更换。
l RNA 在碱性条件下不稳定，避免用高 pH 值溶液溶解 RNA。
