产品说明：

本产品一步法RT-qPCR 2×SuperMix（Taqman）用于RNA分子的定量分析，由于采用Taqman探针进行定量，消除了引物二聚体和非特异性扩增产物带来的假阳性误差。本产品包含MMLV RTase2.0、RNase Inhibitor、热启动型Taq DNA聚合酶、dNTPs和优化的反应缓冲液，浓度为2×。RT-qPCR 反应时，只需加入RNA模板、引物和DEPC处理水，使2×SuperMix溶液的浓度为1×即可进行反应。RNA分样本类型包括总RNA、mRNA、核糖体RNA、tRNA等。核心组分之一MMLV RTase2.0经基因工程改造，热稳定性显著提高，可以耐受55-60度，使得反转录反应可以在50-55度进行，从而消除了RNA二级结构对反转录的抑制作用。Buffer专门针对RT-qPCR进行了优化，MMLV RTase和Taq DNA聚合酶在该Buffer中均有较高活性，且Taqman探针释放信号高，非常适合于Taqman探针型一步法RT-qPCR。

特点：

•  一步法减少RT-qPCR操作时间。

•  避免因多步操作带来的污染。

•  RNA片段的定量 (≤3 kb)。

•  热启动Taq酶，非特异性扩增导致的假阳性信号低，扩增效率高、稳定性好。

•  采用Taqman探针进行定量，消除了引物二聚体和非特异性扩增产物带来的假阳性。

•  MMLV RTase2.0可以在50-55度反转录，从而消除了RNA二级结构对反转录的抑制作用。

适用范围：

RNA样品（mRNA、rRNA等）的RT-qPCR定量，Taqman探针型定量。

保存：

4度保存1个月；-20℃保存1年。

应用举例：一步法 RT-qPCR（Taqman探针）

一步法 RT-PCR 将 RNA 反转录合成 cDNA、目标 cDNA 的 PCR 反应合二为一。以下反应举例为 50 μl 标准一步法RT-PCR 体系， 仅供参考。实际 RT-PCR 条件应根据模板、引物、目的片段大小加以优化，确定最佳反应条件。

1.在无RNase A污染的PCR管中配制如下混合液

* Total RNA 的使用量一般为 10 ng～1 μg；mRNA 的使用量一般为 1ng～1 μg

反应体系中各成分的量可根据以下原则自行调整：

l  Taqman探针的浓度一般在0.05-0.2μM，可能需根据扩增基因和探针的不同而进行浓度优化。

l  一般来说反应体系中引物终浓度为0.2 μM即可得到较好的扩增效果。当反应性能比较差时，可以在终浓度0.1 - 1.0 μM范围内调整引物浓度。

2.按下列条件进行qPCR反应

（1）常规扩增条件                          

（2）退火延伸一步法扩增条件

注意事项

l  本反转录反应条件适合绝大多数RNA，如RNA模板结构复杂，可将反转录温度提高到55度，以提高反转录效果。

l  PCR阶段常规变性时间选择10 sec；快速变性时间最短可选5 sec。

l  常规扩增条件的退火温度可以根据引物的Tm值进行调整，当Tm较高时可以提高退火温度，增加扩增条带的特异性。

l  （1）常规扩增条件下，200-300 bp片段延伸时间72度15 sec，200 bp以内片段72度10 sec；（2）退火延伸一步法扩增条件下，200-300 bp片段延伸时间60度30 sec；200 bp以内片段延伸时间60度20 sec。

l  退火延伸一步法扩增条件下的引物Tm值需要高于延伸温度3-5度。

仪器类型不同，融解曲线采集程序不尽相同，使用仪器默认融解曲线采集程序即可。

注意事项：

l  本品在4度避光保存1个月内稳定，尽量避免反复冻融，以免造成酶活下降。如每次使用量较少，推荐小份分装使用。

l  使用前请上下颠倒以混匀Master Mix，短暂低速离心后即可使用。请勿vortex避免酶失活，影响定量结果。

l  加样过程中轻柔吹打，如果操作不慎导致SuperMix起泡，需离心方可使用。

l  本品使用时额外加入的Taqman荧光探针需避光，因此配制反应体系时应尽量避免强光照射。

l  为了防止环境DNA的污染，反应体系配制时请于超净工作台内进行，配制过程中请使用灭菌枪头、反应管。

l  由于本品检测灵敏度极高，易被空气中气溶胶污染。因此如经常检测某些特定基因，为了避免气溶胶污染，建议使用本公司的 UDG型 Taqman探针型一步法RT-qPCR 2×SuperMix (AQ0412系列)

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