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产品说明
Trt DNA 聚合酶是大肠杆菌重组表达的嗜热细菌来源的热稳定型DNA 聚合酶，分子量为94 kDa。本酶经特殊改造，具有很强扩增能力和延伸速度，扩增片段的长度可达 3-5 kb，延伸速度为 1 -2kb/ min（72℃）。该酶具有 5’→3’聚合酶活性，较弱的 5’→3’外切酶活；无 3’→5’外切酶活性。扩增产物具有 3'-dA 尾巴。另外在 Mn2+离子存在下，Trt DNA 聚合酶具有反转录活性，利用该特性， 可用该酶在同一管中进行反转录反应与 PCR 反应（1 步法 RT-PCR）。本规格包装专门配备了含锰离子的反转录buffer体系。不过Trt DNA聚合酶的反转录酶活性明显低于MMLV-RT，需要的RNA拷贝数较高，检测灵敏度低于MMV-RT。本公司有较传统MMLV-RT热稳定性显著提高的MMLV-RT2.0版本，可以在50-60度进行反转录反应。
以大马哈鱼精子 DNA 作为模板/引物，在 72℃、30 min 内，将 10 nmol 脱氧核糖核苷酸掺入到酸不溶物中所需的酶量，定义为一个活性单位（U）。
浓度：5U/μl
保存条件：-20℃保存特点
Ø 同时具有反转录酶活性与聚合酶活性，能够用于 RNA 的一步法检测；
Ø 热稳定性好：95℃下半衰期超过 40 min；
Ø 耐受 dUTP，dITP；
Ø PCR 产物具有 3’-dA 尾巴，可直接用于 T/A 克隆。适用范围
Ø 常规 PCR 扩增，菌落 PCR；
Ø 高温反转录反应，降低RNA 二级结构对 RT 的影响；
Ø 一步法 RT-PCR。
Component | AE0301A/ AE0302A* | AE0301B/ AE0302B* | AE0301C/ AE0302C* | AE0301D/ AE0302D* |
Trt DNA polymerase | 250U | 250U×5 | 1250U×4 | 2500U×5 |
10×Trt PCR Buffer | 0.5 ml×1 | 1.0 ml×3 | 5.0 ml×2 | 5.0 ml×5 |
5×Trt RT-PCR Buffer# | 0.5 ml×1 | 1.0 ml×3 | 5.0 ml×2 | 5.0 ml×5 |
2 mM dNTPs | -/0.5 ml×1 | -/1.0 ml×3 | -/5.0 ml×2 | -/5.0 ml×5 |
*附带 2mM dNTP 混合物。
#RT-PCR buffer 专门为 RT-PCR 配制，实验需使用 DEPC 处理 ddH2O 和无核酸酶 A 试剂与耗材。质量控制
相关测试表明无外源内切或外切脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶污染；PCR 方法检测无宿主残余 DNA。
室温放置一周，扩增活性无明显改变；但强烈建议不要在室温下长期放置，用毕放回-20 度。酶贮存缓冲液
10mM Tris-HCl (pH 7.5 at 25°C), 300mM KCl, 1mM DTT,0.1mM EDTA, 0.5mg/ml BSA and 50% glycerol.
应用举例1. 常规 PCR
以下反应举例为 50 μl 标准 PCR 体系， 仅供参考。实际 PCR 条件应根据模板、引物、目的片段大小加以优化，确定最佳反应条件。
PCR 组份 | 体积/μl | 终浓度 |
10×Trt PCR Buffer | 5 | 1× |
dNTPs（2.0 mM） | 5 | 0.2 mM |
引物 F（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
引物R（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
DNA Template | Varable* | / |
Trt（5U/μl） | 0.5 | 2.5U |
ddH2O | Varable | / |
总体积 | 50 | / |
*DNA template 可参照如下标准（50 μl PCR 体系）：
l 人类基因组 DNA | 0.1 μg-1 μg |
l λDNA | 0.5 ng-5 ng |
l 质粒 DNA | 0.01 ng-1 ng |
l 大肠杆菌 DNA | 10 ng-100 ng |
常规 PCR 反应条件
95℃ | 5 min | |
95℃ | 15 sec | |
55~72℃ | 20 sec | 30 Cycles |
72℃ | 1-2kb/min | |
72℃ | 3 min |
1. RT-PCR
以下反应举例为 50 μl 标准 RT-PCR 体系，仅供参考。实际 RT-PCR 条件应根据 RNA 模板、引物、目的片段大小加以优化，确定最佳反应条件。
RT-PCR 组份 | 体积/μl | 终浓度 |
5×Trt RT-PCR Buffer | 10 | 1× |
dNTPs（2.0 mM） | 5 | 0.2 mM |
引物 F（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
引物R（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
RNA Template | Varable* | / |
Trt（5U/μl） | 1.5 | 7.5U |
ddH2O（DEPC 处理） | Varable | / |
总体积 | 50 | / |
80℃ | 2 min | |
55℃ | 10 min | |
95℃ | 5 min | |
95℃ | 30 sec |
|
55~72℃ | 30 sec | 30 Cycles |
72℃ | 1kb/min | |
72℃ | 3 min |
注意事项
l Trt DNA 聚合酶具有脱氧核苷酸转移酶活性，因此在 PCR 产物 3’末端通常会加上 1 个多余的腺嘌呤。
l 建议在冰上配置 PCR 反应液后，再放入PCR 仪中进行扩增。这有利于提高扩增的特异性， 减少非特异性扩增，得到良好的PCR 结果。
l 如进行 PCR 扩增后，除目的条带外，还伴随其他杂带，建议适当减少体系中的酶用量，以增加PCR 扩增反应的特异性。
l 本公司 10×PCR Buffer 经大量 PCR 反应实例优化而成，然而对某些 PCR 反应存在一个最优的镁离子浓度。若需要优化镁离子浓度，请购买本公司不含镁离子的 buffer 和 MgCl2/MgSO4。
l 反转录酶活性需要 MnCl2 才能够高效合成 cDNA，本公司 5×RT-PCR Buffer 经大量 RT-PCR 反应实例优化而成，然而对某些 RT 反应存在一个最优的锰离子浓度。若需要优化锰离子浓度，请购买本公司不含锰离子的 5×RT-PCR buffer 和 MnCl2/MnSO4。
警告: 本产品仅限科研实验使用，临床应用安全性和有效性未鉴定，不可用于医疗临床诊断。
