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产品说明
Trt DNA聚合酶是大肠杆菌重组表达的嗜热细菌来源的热稳定型DNA聚合酶，分子量为94 kDa。本酶经特殊改造，具有很强扩增能力和延伸速度，扩增片段的长度可达3-5 kb，延伸速度为1 -2kb/ min（72℃）。该酶具有5’→3’聚合酶活性，较弱的5’→3’外切酶活；无3’→5’外切酶活性。扩增产物具有3'-dA尾巴。另外在Mn2+离子存在下，Trt DNA聚合酶具有反转录活性，利用该特性，可用该酶在同一管中进行反转录反应与PCR反应（1步法RT-PCR）。
活性定义
以大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，在72℃、30 min内，将10 nmol脱氧核糖核苷酸掺入到酸不溶物中所需的酶量，定义为一个活性单位（U）。
浓度：2.5U/μl
保存条件：-20℃保存
特点
Ø 同时具有反转录酶活性与聚合酶活性，能够用于RNA的一步法检测；
Ø 本酶经特殊改造，具有很强扩增能力和延伸速度，可在2kb/ min延伸条件下，有效扩增3-5kb的DNA片段；
Ø 热稳定性好：95℃下半衰期超过40 min；
Ø 耐受dUTP，dITP；
Ø PCR产物具有3’-dA尾巴，可直接用于T/A克隆。
适用范围
Ø 常规PCR扩增；
Ø 菌落PCR；
Ø TA克隆PCR产物添加3’-dA；
Ø 高温反转录反应，降低RNA二级结构对RT的影响；
Ø 一步法RT-PCR。
产品包装规格及组成
Component | AE0351A/ AE0352A* | AE0351B/ AE0352B* | AE0351C/ AE0352C* | AE0351D/ AE0352D* |
Trt DNA polymerase | 100U | 500U | 500U×4 | 1000U×5 |
10×Trt PCR Buffer | 0.5 ml×1 | 1.0 ml×1 | 1.0 ml×4 | 1.0 ml×10 |
5×Trt RT-PCR Buffer# | 0.5 ml×1 | 1.0 ml×1 | 1.0 ml×4 | 1.0 ml×10 |
2 mM dNTPs | -/0.2 ml×1 | -/1.0 ml×1 | -/1.0 ml×4 | -/1.0 ml×10 |
*附带2mM dNTP混合物。
#RT-PCR buffer专门为RT-PCR配制，实验需使用DEPC处理ddH2O和无核酸酶A试剂与耗材。
质量控制
相关测试表明无外源内切酶或外切脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶污染；PCR方法检测无宿主残余DNA，能有效扩增人基因组中的单拷贝基因。
室温放置一周，扩增活性无明显改变；但强烈建议不要在室温下长期放置，用毕放回-20度。
酶贮存缓冲液
10mM Tris-HCl (pH 7.5 at 25°C), 300mM KCl, 1mM DTT,0.1mM EDTA, 0.5mg/ml BSA and 50% glycerol.
应用举例
1．常规PCR
以下反应举例为50 μl标准PCR体系， 仅供参考。实际PCR条件应根据模板、引物、目的片段大小加以优化，确定最佳反应条件。
PCR组份 | 体积/μl | 终浓度 |
10×Trt PCR Buffer | 5 | 1× |
dNTPs（2.0 mM） | 5 | 0.2 mM |
引物F（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
引物R（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
DNA Template | Varable* | / |
Trt（2.5U/μl） | 1.0 | 2.5U |
ddH2O | Varable | / |
总体积 | 50 | / |
*DNA template可参照如下标准（50 μl PCR体系）：
l 人类基因组DNA | 0.1 μg-1 μg |
l λDNA | 0.5 ng-5 ng |
l 质粒DNA | 0.01 ng-1 ng |
l 大肠杆菌DNA | 10 ng-100 ng |
常规PCR反应条件
95℃ | 5 min | |
95℃ |
| |
55~72℃ | 20 sec | 30 Cycles |
72℃ | 1-2kb/min | |
72℃ | 3 min |
2. RT-PCR
以下反应举例为50 μl标准RT-PCR体系， 仅供参考。实际RT-PCR条件应根据RNA模板、引物、目的片段大小加以优化，确定最佳反应条件。
RT-PCR组份 | 体积/μl | 终浓度 |
5×Trt RT-PCR Buffer | 10 | 1× |
dNTPs（2.0 mM） | 5 | 0.2 mM |
引物F（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
引物R（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
RNA Template | Varable* | / |
Trt（2.5U/μl） | 1.0 | 2.5U |
ddH2O（DEPC处理） | Varable | / |
总体积 | 50 | / |
RT-PCR反应条件
80℃ | 2 min | |
55℃ | 10 min | |
95℃ | 5 min | |
95℃ |
| |
55~72℃ | 30 sec | 30 Cycles |
72℃ | 1kb/min | |
72℃ | 3 min |
注意事项
l Trt DNA聚合酶具有脱氧核苷酸转移酶活性，因此在PCR产物3’末端通常会加上1个多余的腺嘌呤。
l 建议在冰上配置PCR 反应液后，再放入PCR仪中进行扩增。这有利于提高扩增的特异性，减少非特异性扩增，得到良好的PCR结果。
l 如进行PCR扩增后，除目的条带外，还伴随其他杂带，建议适当减少体系中的酶用量，以增加PCR扩增反应的特异性。
l 本公司10×PCR Buffer经大量PCR反应实例优化而成，然而对某些PCR反应存在一个最优的镁离子浓度。若需要优化镁离子浓度，请购买本公司不含镁离子的buffer和MgCl2/MgSO4。
l 反转录酶活性需要MnCl2才能够高效合成cDNA，本公司5×RT-PCR Buffer经大量RT-PCR反应实例优化而成，然而对某些RT反应存在一个最优的锰离子浓度。若需要优化锰离子浓度，请购买本公司不含锰离子的5×RT-PCR buffer和MnCl2/MnSO4。
警告: 本产品仅限科研实验使用，临床应用安全性和有效性未鉴定，不可用于医疗临床诊断。
