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产品说明
本酶为热启动Pfu DNA聚合酶，来源于大肠杆菌重组表达的Pyrococcus furiosus DNA聚合酶，分子量为90 KD。其保真性是普通Taq DNA聚合酶的18倍左右。本酶经特殊改造，具有超强扩增能力和延伸速度，扩增片段的长度可达5-6 kb，延伸速度为1 kb/ min（72℃）。该酶具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。扩增产物为平末端，不适合TA克隆。
活性定义
以大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，在72℃、30 min内，将10 nmol脱氧核糖核苷酸掺入到酸不溶物中所需的酶量，定义为一个活性单位（U）。
浓度：2.5U/μl
保存条件：-20℃保存
特点
Ø 本酶为热启动聚合酶，可提高扩增的特异性，减少非特异性扩增和引物二聚体；
Ø 本酶经特殊改造，相比传统Pfu DNA聚合酶，具有加强的扩增能力和延伸速度，可在1kb/ min延伸条件下，有效扩增5-6kb的DNA片段；
Ø 热稳定性好：98℃下半衰期超过60 min；
Ø 保真性最高：保真性是Taq DNA聚合酶的10倍；
Ø 不耐受dUTP、dITP；
Ø PCR产物具有平滑末端，可直接用于平端克隆。
适用范围
Ø 高保真性PCR扩增
Ø 制备基因克隆或蛋白表达用的PCR产物
Ø 平末端PCR克隆(去除3’突出端)
Ø 位点特异性突变
产品包装规格及组成
Component | AE0205A/ AE0206A* | AE0205B/ AE0206B* | AE0205C/ AE0206C* | AE0205D/ AE0206D* |
HS Pfu DNA polymerase | 100U | 500U×5 | 500U×4 | 1000U×5 |
10×Pfu Buffer | 0.5 ml×1 | 0.5 ml×5 | 1.0 ml×10 | 1.0 ml×25 |
2 mM dNTPs | -/0.5 ml×1 | -/0.5 ml×5 | -/1.0 ml×10 | -/1.0 ml×25 |
*附带2mM dNTP混合物。
质量控制
相关测试表明无外源内切酶或外切脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶污染。PCR方法检测无宿主残余DNA，能有效扩增人基因组中的单拷贝基因。
室温放置一周，扩增活性无明显改变；但强烈建议不要在室温下长期放置，用毕放回-20度。
酶贮存缓冲液
20 mM Tris-HCl (pH 8.2), 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 100 mM KCl, 0.1% Nonidet P40, 0.1% Tween 20, and 50% glycerol.
应用举例
注：以下反应举例为50 μl标准PCR体系， 仅供参考。实际PCR条件应根据模板、引物、目的片段大小加以优化，确定最佳反应条件。
组份 | 体积/μl | 终浓度 |
10×Pfu Buffer | 5 | 1× |
dNTPs（2.0 mM） | 5 | 0.2 mM |
引物F（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
引物R（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
Template | Varable* | / |
HS Pfu（2.5U/μl） | 1.0 | 2.5U |
ddH2O | Varable | / |
总体积 | 50 | / |
*DNA template可参照如下标准（50 μl PCR体系）：
l 人类基因组DNA | 0.1 μg-1 μg |
l λDNA | 0.5 ng-5 ng |
l 质粒DNA | 0.01 ng-1 ng |
l 大肠杆菌DNA | 10 ng-100 ng |
PCR反应条件
95℃ | 5min | |
95℃ |
| |
55~72℃ | 20 sec | 30 Cycles |
72℃ | 1kb/min | |
72℃ | 5 min |
注意事项
l 本酶为热启动聚合酶，需95度加热5分钟或98度加热2分钟而激活；因此有利于提高扩增的特异性，减少非特异性扩增和引物二聚体，得到良好的PCR结果。
l Pfu DNA聚合酶具有很强的3’外切核酸酶活性，因此在PCR产物3’为平末端，不适合TA克隆。要进行TA克隆需用Taq DNA聚合酶对PCR产物进行加A处理。
l Pfu DNA聚合酶为高保真酶，忠实性是Taq DNA聚合酶的18倍。
l 建议在冰上配置PCR 反应液后，再放入PCR仪中进行扩增。这有利于提高扩增的特异性，减少非特异性扩增，得到良好的PCR结果。
l 如进行PCR扩增后，除目的条带外，还伴随其他杂带，建议适当减少体系中的酶用量，以增加PCR扩增反应的特异性。
l 本公司Buffer经大量PCR反应实例优化而成，然而对某些PCR反应存在一个最优的镁离子浓度。若需要优化镁离子浓度，请购买本公司不含镁离子的buffer和MgCl2/MgSO4。
l 因该酶与含有尿嘧啶和次黄嘌呤的DNA模板结合后会抑制DNA聚合反应，故dUTP、dITP和含有这些核苷酸的引物不能用于Pfu DNA聚合酶催化的PCR扩增。
警告: 本产品仅限科研实验使用，临床应用安全性和有效性未鉴定，不可用于医疗临床诊断。
