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产品说明
SplintR 连接酶也称为PBCV-1 DNA连接酶或Chorella病毒DNA连接酶，在ATP作为辅助因子条件下，在模板RNA链存在下，高效连接与RNA链互补的相邻的DNA的5´磷酸末端和3´羟基末端。被连接的可以是两条DNA单链；也可以是一条DNA的5’端与3’端与RNA模板以环状形式配对，连接成一个环状的DNA单链。因此非常适合基于锁式探针(Padlock probe)或上下游双探针的microRNA检测。锁式探针是一种较长的单链DNA寡核苷酸片段，两个末端和靶标序列毗邻互补，探针中间的一段序列不与靶标序列配对，可以作为通用引物的结合位点。本酶对于平末端、粘性末端的连接、以及双链DNA、双链RNA、DNA/RNA杂交双链中的单链切口都可以连接。SplintR 连接酶的这种活性可以用于miRNAs等微小RNA和mRNA 的检测与单核苷酸多态性SNP分析。在二代测序和分子诊断等众多领域中，SplintR是富集目的基因的理想选择。SplintR连接酶是RNA检测的最佳用酶，其对RNA介导固定的DNA底物亲和性强（米氏常数 Km = 1 nM），能够在复杂的混合物中检测到亚纳摩尔级的特定RNA。
SplintR 连接酶在广泛条件下，例如10 µM - 1 mMATP，pH 6.5–9.0，均有活性。其中最优反应条件为高于5 mM Mg2+，pH 7.5 - 8.0。37°C反应，补充5 mM Mn2+可以提高反应活性。高于100 mM一价阳离子抑制酶活性。相比dA/U碱基对, 5’端dC/G与dG/C 碱基对对连接反应具有部分抑制作用，特别是相邻的碱基对也是C/G的情况。
本公司SplintR Ligase是重组表达，并经多步纯化制备的重组酶。
活性定义
1单位指在温度为25℃，1× SplintR Ligase 反应缓冲体系的条件下，15min内连接50%的2pmol DNA链（与RNA杂交配对形成的带缺口的DNA/RNA底物）所需的酶量。
活性测定条件
50 mM Tris-HCl ，1 mM ATP，10 mM MgCl2，10 mM DTT(pH 7.5 @ 25℃)，25℃ 温育。
浓度：25U/μl
保存条件：-20℃保存
特点与适用范围
Ø 基于DNA探针连接进行RNA检测
Ø SNP或剪接变异检测
Ø 基于锁式探针(Padlock probe)的microRNA检测
Ø 互补RNA序列配对的单链DNA连接反应
Ø RASL-seq（RNA-mediated oligonucleotide annealing, selection, and ligation with next-generation sequencing）
Ø 热失活：65℃ 加热20min。
产品包装规格及组成
Component | AE1359A | AE1359B |
SplintR Ligase | 2000U | 10kU |
10× SplintR Ligase Buffer | 0.3ml | 1.5ml |
质量控制
相关测试表明无外源内切、外切脱氧核糖核酸酶、RNase污染。PCR方法检测无宿主残余DNA。
酶贮存缓冲液
10 mM Tris-HCl，300 mM NaCl，1 mM DTT，0.1 mM EDTA ，50% Glycerol，pH 7.4 @ 25°C。
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应用实例
1. RNA模板指导的DNA连接反应
建议反应体系中底物浓度在50 nM~2μM之间，体系中酶的浓度低于1 μM（本SplintR酶约为10μM）。在连接反应中，酶的浓度可设为底物浓度的2~3倍。
1）将等摩尔浓度的RNA模板和互补配对的5’磷酸化 DNA混合均匀，75°C 2min后缓慢降温至室温。
2）按下表配制反应体系
反应组分 | 体积/ul |
10× Buffer | 2 |
退火后RNA/DNA底物 | 100ng-1µg |
SplintR Ligase (25U/µl) | 1 |
H2O | Variable |
总体积 | 20 |
3）25°C连接15-60min；
4）65°C加热20min，使酶失活；
5）根据实验目的，进行PAGE电泳检测连接产物，或进行phi29 DNA聚合酶催化的滚环复制。
警告: 本产品仅限科研实验使用，临床应用安全性和有效性未鉴定，不可用于医疗临床诊断。
注意事项
l 本产品需要辅助因子ATP参与反应
l 本酶活性受单价阳离子抑制，因本酶保存在含300mM NaCl的储存液中，建议使用时酶的加入量不要超过反应体积的5%；或将酶稀释5-10倍使反应体系中常见一价阳离子(NaCl、KCl)浓度降低至50 mm以下。
l 反应温度设定在16–37°C，初次尝试建议25°C
l SplintR Ligase浓度为10.5 μM，建议反应体系连接酶浓度为100 nM - 1 μM，或者为底物可连接末端的2倍。 若需要稀释酶，建议使用本公司稀释缓冲液A（DB001）。
l 若来连接效率不理想，建议延长连接反应时间，尽量避免增加酶浓度超过1 μM.
l 如果某一特定底物（例如缺口附近具有多个连续G:C碱基对）的连接效率低，可以降低ATP浓度，通常会显著提高连接效率。推荐本公司Buffer为：1× T4 RNA Ligase Reaction Buffer (目录号AE1351) ，添加终浓度10 μM的ATP。
l RNA模板与待连接的DNA探针之间的配对碱基数总数不低于20bp，可以满足正常的连接反应。缺口两侧的配对区不一定要求相等，单侧配对区最低为4-6个碱基对也可以发生有效连接，但与具体碱基序列有一定相关性。
l 添加SSB蛋白（例如本公司SSB蛋白，目录号AE1902，AE1903，AE1904，AE1905，AE1906）可以提高连接效率，并降低非模板指导的DNA探针与RNA的连接。
l 提高连接反应温度可以提高连接忠实性
