5’ DNA 腺苷化试剂盒能将 5’-磷酸化的DNA 寡核苷酸 5’端腺苷化。试剂盒操作简便，反应组分包括Mth RNA ligase、ATP 和10反应buffer，可以高效的将5’-磷酸化的单链 DNA腺苷化，生成5’-腺苷化DNA（AppDNA）。该试剂盒通常能将 95%的5’-磷酸化DNA 转化成腺苷化 DNA，高效的转化不仅增加产量，还能避免胶回收提纯步骤。使用该试剂盒对 5’-磷酸化ssDNA 进行腺苷化处理时，不需要对 3’端进行保护。

本试剂盒中的Mth RNA ligase是重组表达，并经多步纯化制备的重组蛋白，分子量45.3kDa。

活性测定条件

在1X 5´ DNA Adenylation Buffer（50 mM sodium acetate, pH 6.0, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 0.1 mM EDTA），100 µM ATP下, 65度温育1小时。

浓度：50pmol/μl（2.265mg/ml）

保存条件：-20℃可保存2年，避免反复冻融

特点与适用范围

Ø  单步反应，即可腺苷化

Ø  最简便的腺苷化方法

Ø  腺苷化产物无需纯化

Ø  65度反应消除了底物二级结构的抑制作用

Ø  对 ssDNA 连接头腺苷化后，用于与3’-OH RNA连接建库进行二代测序

Ø  反应体系易于放大，放大6倍对效率没有影响，甚至可以放大到umole级别

产品包装规格及组成

质量控制

经过严格的质控检测，无单链和双链 DNA核酸内切酶、核酸外切酶、RNase、磷酸化酶、内源DNA污染。

酶贮存缓冲液

20 mM Tris-HCl (pH7.5), 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50% glycerol。

警告: 本产品仅限科研实验使用，临床应用安全性和有效性未鉴定，不可用于医疗临床诊断。

应用举例：

1、ssDNA的5’腺苷化

1)  按如下方案配制反应混合液：

2)  65°C温育2小时

3)  85度加热5分钟，失活酶

备注：大量制备5’腺苷化ssDNA时，可以按如下方案操作（20-50ul）：30 µM ssDNA，30 µM Mth RNA Ligase，65°C反应2 h。1 µl蛋白酶K× 37°C×15min失活连接酶，酚氯仿异戊醇(25:24:1)、氯仿异戊醇(49:1)抽提，乙醇沉淀5’腺苷化ssDNA。

2、ssDNA的5’腺苷化与3’-OH RNA样本连接

1)  按如下方案配制反应混合液：

2)      65°C温育2小时

3)      加入1 µl Proteinase K, 37°C温育15min，或加入终浓度10mM EDTA终止反应。Proteinase K 有助于释放被连接酶结合的RNA。

注: 本公司有售Thermostable 5’ App DNA/RNA Ligase（AE1357）。

注意事项

l  该酶转化率低，需要约等摩尔浓度的酶和底物 DNA 进行反应。

l  在二代测序 cDNA文库构建实验中，预腺苷化 DNA 的连接头可用于 RNA 3´ 末端的连接。

l  若需要回收腺苷化的单链核酸并去除蛋白和ATP，可以采用酚氯仿抽提、柱纯化等

l  ssDNA的3’-端可以采用磷酸化、NH2等修饰，从而减少ssDNA环化产物。

l  对于3’-端没有保护的ssDNA底物，建议把ATP浓度提高到0.5mM，从而抑制ssDNA环化与寡聚化

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