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T4 RNA连接酶 2，也被称为 T4 Rnl2（gp24.1），同时具有 RNA 链分子间和分子内连接活性。与 T4 RNA 连接酶 1（NEB #M0204）不同的是， T4 RNA 连接酶 2 对双链 RNA 切刻的连接活性要明显高于对单链 RNA 的末端连接。该酶也可用于连接双链结构中 RNA 3´ 羟基和 DNA 5´ 磷酸基的切刻。
本公司T4 RNA 连接酶 2，截短型是重组表达，并经多步纯化制备的重组蛋白。
活性定义
1 单位指 20 μl 反应体系中， 37℃ 条件下， 30 分钟完全连接 0.4 μg 的 23-mer 和 17-mer RNA等摩尔混合物所需的酶量。
活性测定条件
1× T4 RNA 连接酶 2 反应缓冲液[50 mM Tris-HCl (pH 7.5 @ 25℃)，2mM MgCl2，1 mM DTT，400 μM ATP]， 0.4 μg 的 23-mer 和 17-mer RNA等摩尔混合物，37℃ 温育。
浓度：10U/μl
保存条件：-20℃可保存2年，避免反复冻融
特点与适用范围
Ø 连接粘性末端接头
Ø DNA或RNA序列连接到任何RNA 3´末端
Ø 用于 DNA/RNA 杂交链中，RNA 3´ 羟基与 DNA 5´ 磷酸基的连接
Ø 连接双链 RNA 中切刻
产品包装规格及组成
Component | AE1353A | AE1353B |
T4 RNA连接酶2 | 150U | 750U |
10× T4 RNA连接酶Buffer | 0.2ml | 1.0ml |
50% PEG8000 | 0.2ml | 1.0ml |
质量控制
相关测试表明无外源单链和双链 DNA 核酸内切酶、外切酶、 RNase 以及磷酸酶的污染。PCR方法检测无宿主残余DNA。
酶贮存缓冲液
10 mM Tris-HCl，50 mM KCl，35mM (NH4)2SO4, 0.1 mM DTT，0.1 mM EDTA，50% Glycerol，pH 7.5 @ 25°C
使用实例：3´ OH of RNA和5´磷酸化DNA linker连接反应
1）制备DNA/RNA切刻型底物：将等摩尔比例的DNA/RNA混合物在65度加热3min，在冰上放置2min。制备DNA/RNA切刻型底物可以立即使用，也可以保存在-20度备用。
2）按下表配制反应体系
反应组分 | 体积或浓度 |
10×T4 RNA连接酶Buffer | 2ul |
MgCl2 (100mM) | 1.6 µl |
Nicked DNA/RNA Substrate (10 µM) | 2ul |
50% PEG8000* | 4ul |
T4 RNA Ligase 2 (10 U/µl) | 1ul |
无核酸酶H2O | 9.4ul |
总体积 | 20ul |
3）25℃×1h反应，
3）添加蛋白酶K或终浓度20mM EDTA失活酶，
4）尿素变性PAGE电泳检测酶切产物，或按实验目的进行后续操作。
* 为了提高连接效率，PEG8000 浓度可以高达25%
使用实例：dsRNA中切刻的连接
1）制备dsRNA切刻型底物：将等摩尔比例的dsRNA混合物在65度加热3min，在冰上放置2min。制备dsRNA切刻型底物可以立即使用，也可以保存在-20度备用。
2）按下表配制反应体系
反应组分 | 体积或浓度 |
10×T4 RNA连接酶Buffer | 2ul |
Nicked dsRNA Substrate (10 µM) | 2ul |
T4 RNA Ligase 2 (10 U/µl) | 1ul |
无核酸酶H2O | 15ul |
总体积 | 20ul |
3）25℃×1h反应，
3）添加蛋白酶K或终浓度20mM EDTA失活酶，
5）尿素变性PAGE电泳检测酶切产物，或按实验目的进行后续操作。
警告: 本产品仅限科研实验使用，临床应用安全性和有效性未鉴定，不可用于医疗临床诊断。
注意事项
l 热失活：80℃温育20分钟。
l 可加入核酸酶抑制剂防止RNA污染。
