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产品说明
Ec DNA 连接酶来源于大肠杆菌，分子量为 77kDa，催化双链 DNA 中 5’-磷基和 3’-羟基之间形成磷酸二酯键的 DNA 连接酶。作用与 T4 DNA Ligase 相同，但以 NAD+为辅酶。最适反应 pH 为7.5-8.0 (Tris-HCl buffer)。与 T4 DNA Ligase 可连接粘性末端和平末端相比，本酶只能催化粘性末端 DNA 之间的连接，但如果在 PEG 及高浓度一价阳离子存在的条件下，也能连接平滑末端的 DNA。与 T4 DNA Ligase 能将DNA 的 5′-P 末端与 RNA 的 3′-OH 以及 RNA 的 5′-P 末端与DNA 的 3′-OH 连接不同，本酶不能催化DNA 与 RNA 以及 RNA 之间的连接。对单链 DNA 或 RNA 和平末端 DNA 不具有活性。由于当寡核苷酸与互补的靶 DNA 不完全配对时，也会发生一定比例的连接反应，因此不推荐用于 SNPs 的精准检测。
本公司Ec DNA ligase是重组表达，并经多步纯化制备的重组蛋白。
活性定义
1 单位指在温度为16℃，20ul的1× Ec DNA ligase Buffer缓冲体系的反应条件下，30 min内能连接50%被HindIII消化的6ug λ DNA片段 [5´端浓度为0.12 μM（300 μg/ml）]所的酶量。
活性测定条件
30 mM Tris-HCl（pH 8.0 @ 25℃），4 mM MgCl2，1 mM DTT，26 uM NAD+，50 μg/mL BSA，反应温度16℃。
浓度：10U/μl
保存条件：-20℃
特点
Ø 优先连接dsDNA中的缺口，而非显著连接两个dsDNA片段；
Ø 热失活：65℃加热20min。
适用范围
Ø dsDNA切刻修复；
Ø Okayama 和 Berg cDNA 克隆 。
产品包装规格及组成
Component | AE1311A | AE1311B |
Ec DNA ligase | 2000U | 10000U |
10× Ec DNA ligase Buffer | 0.5ml | 1.0ml×2 |
质量控制
相关测试表明无外源内切、外切脱氧核糖核酸酶、RNase污染。PCR方法检测无宿主残余DNA。
酶贮存缓冲液
10 mM Tris-HCl，50 mM KCl，1 mM DTT，0.1 mM EDTA ，200 µg/ml BSA，50% Glycerol，pH 7.4 @ 25°C。
相关产品
AE1301: T4 DNA ligase
应用实例
1. DNA连接反应
1）按下表配制反应体系
反应组分 | 体积/ul |
10× Buffer | 2 |
粘性末端DNA | 100ng-1µg |
Ec DNA ligase (10U/µl) | 1-2 |
H2O | Variable |
总体积 | 20 |
2) 16°C连接15min
3）对于较长的双链DNA底物，琼脂糖电泳检测连接产物；对于短于100bp的短片段DNA，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测连接产物。
警告: 本产品仅限科研实验使用，临床应用安全性和有效性未鉴定，不可用于医疗临床诊断。
警告: 本产品仅限科研实验使用，临床应用安全性和有效性未鉴定，不可用于医疗临床诊断。
注意事项
l 本产品需要辅助因子NAD+参与反应
l 本产品不适合平末端片段连接，如需连接平末端片段，请使用T4 DNA ligase（AE1301）
l Buffer中的BSA 在-20℃下易产生沉淀，应尽量避免多次反复冻融。短期使用请在 4℃下保存。产生稍许沉淀不影响反应效果。
